近日，深圳北京大学香港科技大学医学中心刘伟研究员团队联合中国科学院深圳先进技术研究院陈宇研究员团队，在iScience杂志在线发表了题为“Ligand preference of EphB2 receptor is selectively regulated by N-glycosylation”的研究成果。该研究首次明确了N-糖基化修饰在EphB2受体与其配体之间的亚型特异性识别中的关键作用，挑战了长期以来“Eph受体与ephrin之间存在混杂的相互作用规则”的传统观点，为深入理解神经元轴突的正确导向及神经网络的精密连接提供新的分子机制。

在哺乳动物中，Eph受体家族是受体酪氨酸激酶（RTKs）家族中最大的亚类，在组织发育过程中发挥着“分子邮政编码”的作用：Eph受体与ephrin配体之间的相互作用，在神经轴突导向、突触稳态维持、组织边界形成、动静脉血管分化等生命活动中都发挥了重要作用。

目前领域内对Eph 受体与ephrin 配体之间的相互作用机制还存在诸多疑问。以往生化研究结果表明：Eph受体与ephrin之间存在混杂的相互作用规则。这虽然能部分解释 Eph受体功能的冗余性，但却无法说明在多种Eph受体和ephrin配体同时表达在同一组织/细胞的情况下，如何实现特定的信号传导。为了揭开这一谜团，研究团队开展了开创性的深入研究。

图1. Eph家族受体和配体的混杂相互作用规律示意图

研究团队首先通过使用不同ephrin配体刺激体外培养的原代皮层神经元细胞，发现内源性EphB2受体与不同亚型ephrin配体的互作具有高度特异性：ephrinB2而非ephrinA5配体可特异性激活EphB2受体。这一发现为后续研究指明了方向。

图2. 原代皮层神经元细胞中EphB2受体与不同亚型ephrin配体的互作具有高度特异性

考虑到以往的生化研究都是在溶液中对纯化的Eph-ephrin蛋白互作进行表征，对受体/配体蛋白的相互作用具有局限性，因此研究团队首次建立了一种基于流式细胞术的Eph-ephrin互作定量分析系统，发现将EphB2受体全长蛋白表达在细胞膜后，其与ephrinA5/ephrinB2配体的相互作用呈现出很好的亚型特异性，其亲和力相差两个数量级，并与原代皮层神经元细胞的配体刺激实验高度吻合。进一步通过结构域互换实验，团队发现EphB2受体的胞外段是调控其发挥配体偏好性的关键结构域。

图3. 本研究首次建立的一种基于流式细胞术的Eph-ephrin互作定量分析系统

接下来，通过检测EphB2受体胞外域在有无配体结合的条件下与脂质体的结合情况，研究团队排除了脂质结合在 EphB2受体对配体特异性结合中的潜在作用。而通过PNGase F糖基化酶消化实验以及N-糖基化质谱，我们证实了EphB2受体的胞外段存在N-糖基化修饰，并且发现N-糖基化位点的N/Q突变使其丧失了对ephrinA5/B2配体的结合特异性，提示N-糖基化修饰是调控EphB2受体与ephrinB2/A5配体特异性互作的重要分子基础。

进一步，通过构建不同N-糖基化位点的N/Q突变，研究团队探究了EphB2受体不同N-糖基化位点对配体偏好性的具体作用。结果表明：Asn265、Asn336位点的去糖基化可增强EphB2受体与ephrinA5的结合亲和力；而Asn428、Asn482位点的去糖基化可减弱EphB2受体结合ephrinB2的能力。提示不同位点的N-糖基化修饰可特异性地调控EphB2受体与不同ephrin配体之间的相互作用。

而通过对EphB2受体进行序列比对分析，研究团队发现其N-糖基化位点在进化上高度保守，且在其它Eph家族成员中也普遍存在。引入N-糖基化位点的回复突变可使EphB6受体恢复其与ephrinB2的结合能力，提示N-糖基化修饰可能是Eph家族潜在的共同调节机制。

最后，研究团队探索了N-糖基化修饰对EphB2受体的生理意义。一方面，我们发现不同发育阶段的大鼠皮层神经元的EphB2受体均存在N-糖基化修饰；另一方面，细胞回缩实验和神经元形态分析实验表明EphB2受体的N-糖基化修饰在ephrin配体诱导的细胞回缩和神经元的树突棘发育都发挥了重要作用。

本论文由医学中心刘伟研究员、肖康博士以及中国科学院先进技术研究院的陈宇研究员共同担任通讯作者。深圳北京大学香港科技大学医学中心博士研究生吕春雨与香港科技大学深圳研究院研究助理原琳为共同第一作者。医学中心技术员杨旸、章东生、赵克力博士后、硕士研究生丁玉珍、浙江大学陈伟教授和胡炜特聘研究员均为本研究做出了重要贡献。本研究获得了国家自然科学基金、广东省自然科学基金及深圳市基础研究基金的资助与支持。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2025.112386

图4. N-糖基化修饰调控Eph受体与ephrin配体特异性相互作用的研究结果小结